Utilización del cultivo plurianual de pataca (Helianthus tuberosus L.) para la producción de hidratos de carbono fermentables a partir de los tallos

La pataca (Helianthus tuberosus L.) es una especie de cultivo con un alto potencial en la producción de hidratos de carbono de reserva en forma de polifructanos, especialmente inulina, que se acumulan temporalmente en los tallos en forma de polisacáridos para translocarse posteriormente a los tubérculos, donde son almacenados. Aunque tradicionalmente el producto de interés del cultivo son los tubérculos, que acumulan gran cantidad de hidratos de carbono fermentables (HCF) cuando se recogen al final del ciclo de desarrollo, en este trabajo se pretende evaluar el potencial de la pataca como productor de HCF a partir de los tallos cosechados en el momento de máximo contenido en HCF, mediante un sistema de cultivo plurianual. Se han realizado los siguientes estudios: i) Determinación del momento óptimo de cosecha en ensayos con 12 clones ii) Potencial del cultivo plurianual de la pataca en términos de producción anual de biomasa aérea y de HCF en cosechas sucesivas, iii) Ensayos de conservación de la biomasa aérea, iv) Estimación de los costes de las dos modalidades de cultivo de pataca para producción de HCF y v) Estimación de la sostenibilidad energética de la producción de bioetanol mediante la utilización de los subproductos. Para la determinación del momento óptimo de la cosecha de la biomasa aérea se ensayaron 12 clones de diferente precocidad en Madrid; 4 tempranos (Huertos de Moya, C-17, Columbia y D-19) y 8 tardíos (Boniches, China, K-8, Salmantina, Nahodka, C-13, INIA y Violeta de Rennes). El máximo contenido en HCF tuvo lugar en el estado fenológico de botón floral-flor que además coincidió con la máxima producción de biomasa aérea. De acuerdo con los resultados obtenidos, la cosecha de los clones tempranos se debería realizar en el mes de julio y en los clones tardíos en septiembre, siendo éstos últimos más productivos. La producción media más representativa entre los 12 clones, obtenida en el estado fenológico de botón floral fue de 23,40 t ms/ha (clon INIA), con un contenido medio en HCF de 30,30 % lo que supondría una producción potencial media de 7,06 t HCF/ha. La producción máxima en HCF se obtuvo en el clon Boniches con 7,61 t/ha y 22,81 t ms/ha de biomasa aérea. En el sistema de cultivo plurianual la cantidad de tallos por unidad de superficie aumenta cada año debido a la cantidad de tubérculos que van quedando en el terreno, sobre todo a partir del 3er año, lo que produce la disminución del peso unitario de los tallos, con el consiguiente riesgo de encamado. El aclareo de los tallos nacidos a principios de primavera mediante herbicidas tipo Glifosato o mediante una labor de rotocultor rebaja la densidad final de tallos y mejora los rendimientos del cultivo. En las experiencias de conservación de la biomasa aérea se obtuvo una buena conservación por un período de 6 meses de los HCF contenidos en los tallos secos empacados y almacenados bajo cubierta. Considerando que el rendimiento práctico de la fermentación alcohólica es de 0,5 l de etanol por cada kg de azúcar, la producción potencial de etanol para una cosecha de tallos de 7,06 t de HCF/ha sería de 3.530 l/ha. El bagazo producido en la extracción de los HCF de la biomasa aérea supondría 11,91 t/ha lo que utilizado para fines térmicos supone más de 3 veces la energía primaria requerida en el proceso de producción de etanol, considerando un poder calorífico inferior de 3.832,6 kcal/kg. Para una producción de HCF a partir de la biomasa aérea de 7,06 t/ha y en tubérculos al final del ciclo de 12,11 t/ha, los costes de producción estimados para cada uno de ellos fueron de 184,69 €/t para los HCF procedentes de la biomasa aérea y 311,30 €/t para los de tubérculos. Como resultado de este trabajo se puede concluir que la producción de HCF a partir de la biomasa aérea de pataca en cultivo plurianual, es viable desde un punto de vista técnico, con reducción de los costes de producción respecto al sistema tradicional de cosecha de tubérculos. Entre las ventajas técnicas de esta modalidad de cultivo, cabe destacar: la reducción de operaciones de cultivo, la facilidad y menor coste de la cosecha, y la posibilidad de conservación de los HCF en la biomasa cosechada sin mermas durante varios meses. Estas ventajas, compensan con creces el menor rendimiento por unidad de superficie que se obtiene con este sistema de cultivo frente al de cosecha de los tubérculos. Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.) (JA) is a crop with a high potential for the production of carbohydrates in the form of polyfructans, especially inulin, which are temporarily accumulated in the stems in the form of polysaccharides. Subsequently they are translocated to the tubers, where they are finally accumulated. In this work the potential of Jerusalem artichoke for fermentable carbohydrates from stems that are harvested at their peak of carbohydrates accumulation is assessed as compared to the traditional cultivation system that aims at the production of tubers harvested at the end of the growth cycle. Tubers are storage organs of polyfructans, namely fermentable carbohydrates. Studies addressed in this work were: i) Determination of the optimum period of time for stem harvesting as a function of clone precocity in a 12-clone field experiment; ii) Study of the potential of JA poly-annual crop regarding the annual yield of aerial biomass and fermentable carbohydrates (HCF) over the years; iii) Tests of storage of the aerial biomass, iv) Comparative analysis of the two JA cultivation systems for HCF production: the poly-annual system for aerial biomass harvesting versus the annual cultivation system for tubers and v) Estimation of the energy sustainability of the bioethanol production by using by-products of the production chain. In order to determine the best period of time for aerial biomass harvesting twelve JA clones of different precocity were tested in Madrid: four early clones (Huertos de Moya, C-17, Columbia and D-19) and eight late clones (Boniches, China, K-8 , Salmantina, Nahodka, C-13, INIA and Violeta de Rennes). Best time was between the phenological stages of floral buds (closed capitula) and blossom (opened capitula), period in which the peak of biomass production coincides with the peak of HCF accumulation in the stems. According to the results, the early clones should be harvested in July and the late ones in September, being the late clones more productive. The clone named INIA was the one that exhibited more steady yields in biomass over the 12 clones experimented. The average potential biomass production of this clone was 23.40 t dm/ha when harvested at the floral buds phenological stage; mean HCF content is 30.30%, representing 7.06 t HCF/ha yield. However, the highest HCF production was obtained for the clone Boniches, 7.61 t HCF/ha from a production of 22.81 t aerial biomass/ha. In the poly-annual cultivation system the number of stems per unit area increases over the years due to the increase in the number of tubers that are left under ground; this effect is particularly important after the 3rd year of the poly-annual crop and results in a decrease of the stems unit weight and a risk of lodging. Thinning of JA shoots in early spring, by means of an herbicide treatment based on glyphosate or by means of one pass with a rotary tiller, results in a decrease of the crop stem density and in higher crop yields. Tests of biomass storing showed that the method of keeping dried stems packed and stored under cover results in a good preservation of HCF for a period of six months at least. Assuming that the fermentation yield is 0.5 L ethanol per kg sugars and a HCF stem production of 7.06 t HCF/ha, the potential for bioethanol is estimated at 3530 L/ha. The use of bagasse -by-product of the process of HCF extraction from the JA stems- for thermal purposes would represent over 3 times the primary energy required for the industrial ethanol production process, assuming 11.91 t/ha bagasse and 3832.6 kcal/kg heating value. HCF production costs of 7.06 t HCF/ha yield from aerial biomass and HCF production costs of 12.11 t HCF/ha from tubers were estimated at 184.69 €/t HCF and 311.30 €/t HCF, respectively. It can be concluded that the production of HCF from JA stems, following a poly-annual cultivation system, can be feasible from a technical standpoint and lead to lower production costs as compared to the traditional annual cultivation system for the production of HCF from tubers. Among the technical advantages of the poly-annual cultivation system it is worth mentioning the reduction in crop operations, the ease and efficiency of harvesting operations and the possibility of HCF preservation without incurring in HCF losses during the storage period, which can last several months. These advantages might compensate the lower yield of HCF per unit area that is obtained in the poly-annual crop system, which aims at stems harvesting, versus the annual one, which involves tubers harvesting.

Estudios de eficiencia en el uso de la luz y estimaciones de biomasa en cultivos energéticos de Salix sp. en Central New York, USA

La productividad es un factor importante que influye en la viabilidad económica de un cultivo energético de sauce y maximizarla se convierte en un tema primordial. Esta investigación está directamente relacionada con dicha característica. La productividad varía según los clones cultivados, que pueden ser mejorados y seleccionados genéticamente. Los programas genéticos requieren de una información previa (productividad media en función del porte y número de los tallos, características de las hojas, resistencia a las plagas, etc.) que ayudará a obtener clones más productivos y resistentes. Por ello, nuestra investigación consta de dos estudios: (1) Evaluación de la eficiencia del uso de la luz o LUE (Light Use Efficiency). El incremento de biomasa y la eficiencia del uso de la luz (LUE) fue estudiado en 15 clones del genero Salix durante los meses de junio a septiembre de 2011 en Belleville (Central New York, USA). Los objetivos de este estudio fueron: (1) Evaluar la eficiencia del uso de la luz en la explicación a la variación en la producción de biomasa y (2) Determinar si existen diferencias significativas entre clones evaluando el índice de área foliar (LAI) y algunos componentes de las hojas (N, P, K,…). Se concluye que la variación de biomasa está relacionada con la cantidad de luz interceptada y con la eficiencia de su uso. Dicha información debe de ser transferida para ayudar a mejorar genéticamente los futuros clones a comercializar, con el fin de maximizar la productividad y aumentar la resistencia a plagas. (2) Estimación de biomasa a través de modelos de regresión. Los estudios de investigación relacionados con la productividad requieren estimaciones no destructivas de la biomasa aérea. Sin embargo, el nivel de precisión requerido y la inversión de tiempo son excesivos para operaciones comerciales con grandes extensiones (plantaciones de 10.000 ha). Por esta razón, se estudia el nivel de especificidad (específico, intermedio y general) en la toma de datos de campo sobre los mismos 15 clones (12 de ellos se pueden agrupar en 5 grupos según su genotipo origen) del genero Salix, empleados en el estudio anterior. Para todos los niveles estudiados se observaron diferencias significativas. Pero desde nuestro punto de vista, las diferencias obtenidas no son relevantes. Para validar los modelos finalmente seleccionados se calcularon los porcentajes de error entre la biomasa estimada por los modelos de regresión calculados y la biomasa real obtenida tras los pesajes de biomasa, todo ello se realizó para cada clon según nivel de especificidad. ABSTRACT Productivity is an important factor in the economic viability of a willow crop´s, therefore, maximize it becomes a major factor. This study is directly related to this feature. Productivity, among other factors, may vary depending on different clones, which can be improved and selected genetically. Genetic programs require prior information (average productivity, size and number of stems, leaf characteristics, resistance to pests, etc.) to help you get more productive clones resistant to local pests. Our research consists of two studies: (1) Evaluation of the efficiency of use of light (LUE, Light Use Efficiency). The increase of biomass and light use efficiency (LUE) was tested on 15 clones of the genus Salix during June and September 2011 in Belleville (Central New York, USA). The objectives of this study were: (1) evaluate the light use efficiency and its relationship with the variation in biomass production and (2) determine whether there are significant differences between clones evaluating the leaf area index (LAI) and some traits of the leaves (N, P, K). We studied the correlation with the light use efficiency. It is concluded that the variation of biomass was related to the amount of light intercepted and its efficiency. Such information must be transferred to help improve future genetically clones to market in order to maximize productivity and increase resistance to pests. (2) Estimation of biomass through regression models. Research studies related to productivity estimates require precision and non destructive biomass. However, the level of accuracy required and the investment of time are excessive for large commercial operations with extensions (plantations of 10,000 ha). Precisely for this reason, we study the level of specificity (specific, intermediate and general) in making field data on the same 15 clones (12 of them can be grouped into five groups according to their genotype origin) of the genus Salix, employees in the previous study. For all levels studied some significant differences were observed. But from our practical standpoint, the differences are not relevant. Finally, to validate the selected models, we calculated the percent of bias between estimated biomass (by the regression models) and real biomass obtained after the weighing of biomass, all this process was done for each clone by level of specificity.

Compatibilidad de Orius laevigatus (Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) y Nesidiocoris tenuis (Reuter)(Hemiptera: Miridae), depredadores importantes en cultivos hortícolas protegidos, con nuevas barreras físicas selectivas y modernos plaguicidas

La nueva legislación en materia fitosanitaria se dirige hacia una Gestión Integrada de Plagas (GIP). Estos programas dan preferencia a aquellos métodos más respetuosos y sostenibles con el medio ambiente, siendo piezas claves en ellos el control biológico, el físico y otros de carácter no químico. Sin embargo, el uso de insecticidas selectivos es a veces necesario para el adecuado manejo de plagas en cultivos hortícolas. Por ello, el objetivo general de este estudio es aportar conocimientos para mejorar el control de plagas en cultivos hortícolas, mediante la integración de tres estrategias de lucha: biológica, física y química. Una parte de este trabajo ha consistido en el estudio de los posibles efectos que mallas tratadas con insecticida (bifentrin) pudieran provocar mediante diferentes ensayos de laboratorio, invernadero y campo, en los enemigos naturales Orius laevigatus (Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) (depredador de trips), Nesidiocoris tenuis (Reuter) (Hemiptera: Miridae) (depredador de mosca blanca y Tuta absoluta (Meirick) (Lepidoptera: Gelechiidae)), y otros agentes de biocontrol comúnmente usados en cultivos hortícolas protegidos. Este tipo de mallas se han empleado con éxito en entomología médica para controlar mosquitos vectores de la malaria, y actualmente se está trabajando en su desarrollo para uso agrícola como método de exclusión, y método directo de control de plagas. En los ensayos realizados en laboratorio, O. laevigatus y N. tenuis no fueron capaces de detectar la presencia de bifentrin en el ensayo de preferencia. Además, no se produjo mortalidad a corto plazo (72 horas) en ambos chinches depredadores. Por el contrario, se registró una elevada mortalidad cuando se expusieron por contacto a la malla tratada durante 72 horas en cajas de dimensiones reducidas (10 cm de diámetro X 3 cm de altura). En ensayos llevados a cabo bajo condiciones más reales de exposición, en un invernadero experimental con jaulas de 25 X 25 X 60 cm de altura, no se produjo ningún efecto en la mortalidad a corto plazo (72 horas) o en los parámetros reproductivos de O. laevigatus y N. tenuis. Finalmente, en ensayos de campo realizados en túneles semi-comerciales (8 m de largo X 6,5 m de ancho X 2,6 m de altura), ni las condiciones ambientales [temperatura, humedad relativa, radiación ultravioleta (UV) y fotosintéticamente activa (PAR)], ni los enemigos naturales, se vieron afectados por la presencia de la malla tratada con bifentrin en el cultivo. Sin embargo, los resultados no fueron concluyentes, debido al bajo establecimiento de los agentes de biocontrol liberados. Por lo tanto, más estudios son necesarios en invernaderos comerciales para confirmar los resultados preliminares de compatibilidad. Además, en este trabajo se han evaluado los efectos letales (mortalidad) y subletales (parámetros reproductivos) de seis modernos insecticidas sobre los chinches depredadores O. laevigatus y N. tenuis, mediante ensayos de laboratorio y persistencia. Los ensayos se realizaron por contacto residual, aplicando los insecticidas a la dosis máxima de campo sobre placas de cristal (laboratorio) o plantas (persistencia). Los productos fitosanitarios se seleccionaron por representar a un grupo de modernos plaguicidas con modos de acción en principio más selectivos para los enemigos naturales que antiguos plaguicidas como organoclorados, oroganofosforados o carbamatos, y por su uso frecuente en cultivos hortícolas donde O. laevigatus y N. tenuis están presentes. Todos ellos están incluidos o en proceso de inclusión en la lista comunitaria de sustancias activas para uso agrícola, Anexo I de la Directiva 91/414/CEE: abamectina y emamectina (avermectinas neurotóxicas, activadoras del canal del cloro), deltametrina (piretroide neurotóxico, modulador del canal del sodio, control positivo), flubendiamida (neurotóxico, modulador del receptor de rianodina), spinosad (naturalito neurotóxico, agonistas/antagonistas del receptor de nicotínico acetilcolina) y spiromesifen (inhibidor de la acetil CoA carboxilasa). El estudio mostró que O. laevigatus fue más susceptible a los insecticidas que N. tenuis. Además, los resultados revelaron que flubendiamida y spiromesifen fueron compatibles con los dos enemigos naturales estudiados, y por tanto se podrían usar en programas de GIP. Por el contrario, los insecticidas abamectina, deltametrina, emamectina y spinosad no fueron selectivos para ninguno de los chinches depredadores. Sin embargo, los estudios de persistencia demostraron que a pesar de que estos insecticidas no proporcionaron selectividad fisiológica, pueden proporcionar selectividad ecológica en algunos casos. Abamectina, deltametrina, emamectina y spinosad podrían ser compatibles con N. tenuis si el enemigo natural es introducido en el cultivo 4 días después de su aplicación. En el caso de O. laevigatus, abamectina, deltametrina y spinosad se clasificaron como persistentes, por lo tanto es necesario completar el estudio con experimentos de semi-campo y campo que determinen si es posible su uso conjunto en programas de GIP. Por otro lado, emamectina podría ser compatible con O. laevigatus si el enemigo natural es introducido en el cultivo 7 días después de su aplicación. Por último, se ha comprobado la selectividad de tres insecticidas aceleradores de la muda (MACs) (metoxifenocida, tebufenocida y RH-5849) sobre O. laevigatus y N. tenuis. Además de realizar estudios para evaluar la toxicidad en laboratorio de los insecticidas por contacto residual e ingestión (principal modo de acción de los MAC´s), se extrajo RNA de los insectos y con el cDNA obtenido se secuenció y clonó el dominio de unión al ligando (LBD) del receptor de ecdisona correspondiente a O. laevigatus (OlEcR-LBD) y N. tenuis (NtEcR-LBD). Posteriormente, se obtuvo la configuración en tres dimensiones del LBD y se estudió el acoplamiento de las moléculas de los tres insecticidas en la cavidad que forman las 12 α-hélices que constituyen el EcR-LBD. En el caso de N. tenuis se debe mencionar que no fue posible la obtención de la secuencia completa del LBD. Sin embargo, se obtuvo una secuencia parcial (hélice 6-hélice 11), que mostró una alta conservación de aminoácidos con respecto a la obtenida en O. laevigatus. Los ensayos de toxicidad mostraron que metoxifenocida, tebufenocida y RH-5849 no produjeron ningún efecto nocivo en ambos depredadores. Además, los estudios de modelado por homología y acoplamiento molecular llevados a cabo con O. laevigatus, también indicaron que los MACs no produjeron ningún efecto deletéreo en este enemigo natural. Por lo tanto, estos compuestos pueden ser aplicados de manera segura en programas de GIP en los cuales O. laevigatus y N. tenuis estén presentes. ABSTRACT The new pesticide legislation on pest control is aimed at integrated pest management (IPM). These programs are based on the most environmentally sustainable approaches, where biological, physical control and other non-chemical methods are the cornerstone. However, selective pesticides are often required for pest management on horticultural crops. Therefore, the main goal of this study is to provide knowledge to improve pest control on horticultural crops through the integration of three strategies: biological, physical and chemical. Firstly, the effects of insecticide treated nets (bifenthrin) were evaluated in different laboratory, greenhouse and field experiments on the natural enemies Orius laevigatus (Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) (predator of thrips), Nesidiocoris tenuis (Reuter) (Hemiptera: Miridae) (predator of whiteflies and Tuta absoluta (Meirick) (Lepidoptera: Gelechiidae)), and other biocontrol agents commonly used on protected horticultural crops. These types of nets have been successfully used in medical entomology to control mosquito malaria vectors, and work is currently being done on their use as exclusion barriers and as a direct method of pest control in agriculture. In experiments made under laboratory conditions, O. laevigatus and N. tenuis were not able to detect the presence of bifenthrin in a dual-choice test. Furthermore, no shortterm mortality (72 hours) was recorded on both predatory bugs. In contrast, a high mortality rate was found when they were exposed by contact to the bifenthrin-treated net for 72 hours in small cages (10 cm diameter X 3 cm high). In assays carried out under more realistic conditions of exposure, in an experimental greenhouse with cages of 25 X 25 X 60 cm high, short-term mortality (72 hours) and reproductive parameters were not affected. Lastly, in field experiments carried out in semi-commercial tunnels (8 m long X 6.5 m width X 2.6 m high), neither environmental conditions [temperature, relative humidity, ultraviolet (UV) and photosynthetically active radiation (PAR)] nor natural enemies were affected by the presence of the bifenthrin-treated net on the crop. However, results were not conclusive, mainly due to a low settlement of the released biocontrol agents, and further studies are needed in commercial greenhouses to confirm our preliminary results of compatibility. Secondly, the lethal (mortality) and sublethal effects (reproductive parameters) of six modern pesticides on the predatory bugs O. laevigatus and N. tenuis has been evaluated through laboratory and persistence experiments. Trials were carried out by residual contact, applying the insecticides to the maximum field recommended concentration on glass plates (laboratory) or plants (persistence). Insecticides were chosen as representatives of modern pesticides with a more selective mode of action on natural enemies than organochlorine, organophosphorus and carbamate insecticides. Moreover, they were also chosen because of their frequent use on horticultural crops where O. laevigatus and N. tenuis are present. All of them have been included or have been requested for inclusion in the community list of active substances on the agricultural market, Annex I of the European Directive 91/414/EEC: abamectin and emamectin (neurotoxic avermectins, chloride channel activators), deltamethrin (neutotoxic pyrethroid, sodium channel modulator, positive commercial standard), flubendiamide (neurotoxic, rianodine receptor modulator), spinosad (neurotoxic naturalyte, nicotinic acetylcholine receptor allosteric activator) and spiromesifen (inhibitors of acetyl CoA carboxylase). The study showed that O. laevigatus was more susceptible to all the studied pesticides than N. tenuis. In addition, the research results indicated no impact of flubendiamide and spiromesifen on the two natural enemies studied under laboratory conditions. Consequently, both pesticides are candidates to be included in IPM programmes where these biocontrol agents are present. On the other hand, abamectin, deltamethrin, emamectin and spinosad were not selective for both predatory bugs in laboratory experiments. However, persistence test demonstrated that in spite of the lack of physiological selectivity, these pesticides can provide ecological selectivity in some cases. Abamectin, deltamethrin, emamectin and spinosad could be compatible with N. tenuis if the mirid bug is released 4 days after the insecticide treatment on the crop. With regard to O. laevigatus, abamectin, deltamethrin and spinosad were classified as persistent in our assays, thus the study should be completed with semi-field and field experiments in order to ascertain their possible joint use in IPM programs. In contrast, emamectin could be compatible with O. laevigatus if the pirate bug is released 7 days after the insecticide treatment on the crop. Finally, the selectivity of three moulting accelerating compounds (MACs) (methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849) has also been evaluated on O. laevigatus and N. tenuis. In addition to laboratory experiments to evaluate the toxicity of the insecticides by residual contact and ingestion, molecular approaches were used as well. RNA of both insects was isolated, cDNA was subsequently synthesized and the complete sequence of the ligand binding domain (LBD) of the ecdysone receptor of O. laevigatus (OlEcR-LBD) and N. tenuis (NtEcR-LBD) were determined. Afterwards, the three dimensional structure of LBD was constructed. Finally, the docking of the insecticide molecules in the cavity delineated by the 12 α-helix that composed the EcRLBD was performed. In the case of N. tenuis, it should be noted that in spite of intensive efforts, we did not manage to complete the sequence for the LBD.However, a partial sequence of the LBD was obtained (helix 6-helix 11), and a strong conservation between the amino acids of N. tenuis and O. laevigatus was observed. Results showed no biological activity of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849, on both predatory bugs. Moreover, modeling of the OlEcR-LBD and docking experiments also suggested that MACs were devoid of any deleterious effect on O. laevigatus. Therefore, our results indicate that these compounds could be safely applied in IPM programs in which O. laevigatus and N. tenuis are present.

In vitro evaluation of commercial fibrolytic enzymes for improving the nutritive value of low-quality forages.

The aim of this work was to assess the effects of four doses of three commercial fibrolytic enzymes on ruminal fermentation of rice straw, maize stover and Pennisetum purpureum clon Cuba CT115 hay in batch cultures of ruminal micro-organisms from sheep. One enzyme was produced by Penicillium funiculosum (PEN) and two were from Trichoderma longibrachiatum (TL1 and TL2). Each liquid enzyme was diluted 200 (D1), 100 (D2), 50 (D3) and 10 (D4) - fold and applied to each substrate in quadruplicate over time and incubated for 120 h in rumen fluid. The D4 dose of each enzyme increased (P<0.05) the fractional rate of gas production and organic matter effective degradability for all substrates, and TL2 had similar effects when applied at D3. In 9 h incubations, PEN at D4, TL1 at all tested doses, and TL2 at D2, D3 and D4 increased (P<0.05) volatile fatty acid production and dry matter degradability for all substrates. The commercial enzymes tested were effective at increasing in vitro ruminal fermentation of low-quality forages, although effective doses varied with the enzyme.

Estudio de los efectos en el viñedo de la modificación del déficit hídrico continuo en los periodos anterior y posterior al envero (cv. Cabernet Sauvignon; Vitis vinifera L.)

En regiones semiáridas, con veranos cálidos, evapotranspiraciones elevadas, humedades relativas bajas, además de precipitaciones intermitentes y escasas (400 mm al año) que reducen la recarga del perfil en invierno, se puede ver afectada la productividad y sostenibilidad de los viñedos. Por eso en estas zonas puede ser necesario utilizar el riego suplementario para mantener la calidad y aumentar la productividad. En este marco de circunstancias es en el que se desarrolla la mayoría de la viticultura española, y en concreto en la zona centro donde se realizó el estudio. Con este trabajo se pretende estudiar la influencia del agua del riego, con distintas dosis y aplicada en diferentes fases de crecimiento y maduración de la baya, en la producción y calidad de la uva. Se estudió la influencia del déficit moderado continuo aplicado antes y después de envero, en el aprovechamiento de los recursos ambientales y en la respuesta del cv. Cabernet Sauvignon. El ensayo se desarrolló en 2010 y 2011 en la finca “La Alcoholera”, perteneciente a bodegas LICINIA S.L., ubicada en la localidad de Chinchón, Comunidad de Madrid, España. Durante 2010 y 2011 se realizaron estudios en cepas del cv. Cabernet Sauvignon (clon 15), injertadas sobre 41B y plantadas en 2005. Con poda corta en Cordón Royat unilateral de 80 cm de altura, y cuya vegetación alcanzó una altura de 97 cm. Las cepas del ensayo fueron conducidas verticalmente en espaldera (VSP), con 10 yemas por metro lineal. Las plantas dentro de la fila fueron separadas 1 m y la distancia de la calle fue de 3 m. La orientación de las filas norte – sur. Se plantearon cuatro tratamientos experimentales con diferentes dosis y momento de aplicación del riego. - T: Testigo. Déficit ligero, con un aporte continuado de agua desde floración (420 mm). - DMc: Déficit moderado continuo. Manejo del riego convencional, empezando en pre-envero (154 mm) - DM1: Déficit moderado a partir de pre-envero. Aporte de riego continuado desde floración reduciéndose la dosis de riego en pre-envero (312 mm). - DM2: Déficit moderado hasta pre-envero. Se empezó a regar a partir de preenvero (230 mm). Se observó que bajo condiciones de estrés hídrico leve, el crecimiento se reduce disminuyendo la migración de fotoasimilados hacia los órganos vegetativos. Generando menor área foliar en las plantas sometidas a déficit hídrico moderado entre floración y cuajado. Disminuyendo su consumo. En maduración la humedad del suelo dependió principalmente del riego aplicado y del consumo de la planta; dicho consumo dependió a la vez del desarrollo foliar del canopy y de la necesidad hídrica de la vid. El aumento del déficit hídrico disminuyó el contenido de agua en el suelo, lo que provocó diferencias en el estado hídrico y en el intercambio gaseoso de las hojas. En condiciones de déficit moderado, la fotosíntesis se encontró altamente correlacionada con el potencial hídrico foliar medido a mediodía solar. Además en condiciones de déficit moderado continuo la disponibilidad hídrica, la demanda atmosférica y el nivel de hidratación de las hojas, interaccionaron de forma compleja en la regulación estomática de las hojas, condicionando el intercambio gaseoso y la eficiencia en el uso del agua. Al aumentar el volumen de agua aplicado el peso de madera de poda por metro de fila fue superior. Las diferencias encontradas en el rendimiento fueron debidas a las diferencias en el peso de baya. El cual estuvo condicionado por la estrategia de riego, ya que, el déficit hídrico moderado antes de envero fue más crítico para el rendimiento que el déficit impuesto durante la madurez. Por otro lado, la biomasa dependió de la actividad fisiológica de la planta, la cual fue altamente dependiente de la disponibilidad hídrica. Déficit hídrico moderado aplicado de cuajado a envero, generó bayas más pequeñas y aumentó la relación hollejo:pulpa. El déficit moderado aplicado después de envero favoreció la acumulación de IPT y antocianos extraíbles, mejorando la calidad de la uva, pero disminuyó la acidez de la baya. El riego aplicado de envero a vendimia desaceleró la concentración de azúcares en bayas que fueron sometidas a déficit antes de pre-envero. ABSTRACT Mediterranean climate is characterized by hot summers, high evapotranspiration rates, and scarce precipitations (400 mm per year) during grapevine cycle. These extremely dry conditions affect vineyard productivity and sustainability. Supplementary irrigation is needed practice in order to maintain yield and quality. Almost all Spanish grape growing regions are characterized by these conditions, especially in the center region, where this trial was performed. The main objective of this work is to study the influence of water irrigation on yield and quality. For this aim, different levels of irrigation (mm of water applied) were applied during different stages of growth and berry maturity of Caberent Sauvignon grapevines. The work was conducted from 2010 to 2011 and located in Licinia (40º 12´ N, 3º 28´ W), Madrid, Spain. The cultivar utilized was Cabernet Sauvignon, clone 15 grafted onto rootstock 41B, planted in 2005. The vineyard was oriented north-south, with spacing on 3 meters between rows and 1 meter between plants. Vines were spurpruned to 10 buds per meter and trained in unilateral cordon with a height of 80 cm. Shoots were positioned vertically (VSP). Considering the amount of water and the moment of the application, four experimental treatments were applied: - T: Control sample. Slight deficit (420 mm) applied from bloom to maturity. - DMc: Continuous moderate deficit. Traditional irrigation: application of 154 mm of water from pre-veraison to maturity. - DM1: Deficit moderate from pre-veraison. Irrigation of 312 mm of water from bloom to pre-veraison. - DM2: Deficit moderate to pre-veraison. Irrigation of 230 mm of water from preveraison to maturity Under moderated water stress conditions it was seen than leaf growth decreases due to the reduction of migration of photo-assimilates to vegetative organs. Vines with moderate water deficit between flowering and ripening develop less leaf area and decrease its water consumption. During maturation of berries, soil moisture depends on irrigation and plant consumption. This consumption further depends on vegetation development and on the vine needs for water. By increasing water deficit, the water content in the soil decreases. This causes differences in leaf water status and in the gases exchange. Under moderate deficit conditions, photosynthesis was found highly correlated with midday leaf water potential. Further, atmospheric demand and the level of leaves hydration interact in complex ways in the stomatal regulation, which affects leaf gas exchange and the efficiency of water use. The amount of water applied is directly proportional to pruning weight. Changes in berry weight cause differences in yield ratios. The differences in berry weights are conditioned by the irrigation strategy, the moderate water deficit before veraison influences more than the deficit applied from veraison. Biomass generated for the plant depends on its physiological activity, which is highly related to the water availability. Moderate water deficit applied from fruit set to ripening generates smaller berries, increasing the pulp/skin ratio. Moderate deficit applied after veraison promotes the accumulation of extractables anthocyans and TPI. Despite this treatment improves color parameters of the grapes, it decreases its total acidity. Irrigation applied from veraison to harvest slows down sugar accumulation in berries compared to those under deficit before veraison conditions.

Respuestas anatómico fisiológicas frente a estrés hídrico en plantaciones de especies de crecimiento rápido para la producción de biomasa

El objetivo general de la presente Tesis es identificar algunas de las características anatómico-fisiológicas que confieren la capacidad de alcanzar una mejor productividad bajo clima mediterráneo a plantas de diversos genotipos de los géneros Populus y Eucalyptus, caracterizados por su carácter pionero, elevado crecimiento y vulnerabilidad a la cavitación. En los dos primeros capítulos se hace un seguimiento de la conductancia estomática a una selección de clones de eucalipto cultivados en invernadero, sometidos a diferentes dotaciones hídricas. Se realizaron además mediciones periódicas del pH de la savia del tallo y de la pérdida de conductividad hidráulica para investigar su implicación en la regulación química e hidraúlica del cierre estomático. Las variaciones en el pH de la savia obtenidas parecen responder a cambios en el déficit de presión de vapor de agua atmosférico y no a diferencias en la disponibilidad de agua en el suelo. La conductancia estomática presentó una correlación positiva significativa con el pH de la savia, pero no con la conductividad hidráulica. La variabilidad de la conductividad hidráulica máxima se discute a la luz de recientes investigaciones sobre los materiales constituyentes de las membranas de las punteaduras. Los clones que mostraron mayores conductancias hidráulicas y estomáticas presentaron valores más altos de producción y supervivencia, poniendo de manifiesto la utilidad del estudio de estas variables. Por el contrario, los valores más bajos de conductancia estomática e hidraúlica se encontraron en clones que han resultado un fracaso en plantaciones comerciales, en particular, fue destacable el mal resultado de un clon procedente de autocruzamiento respecto de otros híbridos. En el tercer capítulo de la tesis se estudian características anatómicas y funcionales del xilema relacionadas con la eficiencia en el transporte de agua a las hojas, y que pueden afectar directa o indirectamente a la transpiración y al crecimiento. Los estudios anatómicos fueron realizados sobre brotes anuales de chopo en una plantación situada en Granada, en condiciones de riego limitante. La combinación de rasgos anatómicos más favorable de cara a la producción de biomasa fue una densidad alta de vasos de diámetro intermedio. Los clones más productivos figuraron entre los más resistentes a la cavitación. Para estudiar el crecimiento de masas arboladas se utilizan frecuentemente parámetros fisiológicos como el índice de area foliar (LAI). La estimación del LAI a partir de fotografías hemisféricas aplicada a tallares de chopo plantados a alta densidad y a turno corto para biomasa se lleva a cabo mediante una metodología reciente empleada y discutida en el cuarto capítulo de la Tesis. Los resultados muestran que las diferencias de producción existentes entre genotipos, localidades de medición con diferentes dosis de riego, y años, pueden predecirse a partir de la determinación del índice de área foliar tanto por métodos directos como indirectos de estimación. Tanto los estudios realizados en eucalipto como en chopo han mostrado que los genotipos con menores producciones de biomasa en campo alcanzaron los menores valores de conductancia estomática en las condiciones más favorables así como el menor número de vasos en el xilema. La estrecha relación entre crecimiento y LAI confirma una vez más la importancia del desarrollo de la copa para sostener un buen crecimiento. El mayor desarrollo de la copa y rendimiento en biomasa se midieron en uno de los clones con un número de vasos más elevado, y menor vulnerabilidad a la cavitación en condiciones de estrés. Estos resultados ponen de manifiesto la importancia de las características anatómicas y funcionales del xilema como condicionantes del patrón de crecimiento de las plantas y el comportamiento de los estomas. ABSTRACT A number of anatomical xylem traits and physiological variables were analyzed in genotypes of both the Populus and Eucalyptus genera with the main aim of identifying traits in the genotypes which confer the ability to produce an acceptable biomass yield under Mediterranean climatic conditions. In the first two chapters of this PhD, the results of two experiments carried out on several clones of the species Eucalyptus globulus Labill. are presented. Chapters three and four include the results of another two trials on four poplar hybrid genotypes. One of the initial plant responses to water stress is stomatal closure, which can be triggered by hydraulic and/or chemical signals. The two first chapters of this PhD deal with trials in which stomatal conductance and percentage loss of hydraulic conductivity were monitored on a set of eucalyptus clones supplied by ENCE (former National Cellulose Company) and currently used in the company’s own commercial plantings. The experimental trials were carried out in greenhouses and the plants were submitted to two different watering regimes. The pH of the stem sap was periodically measured as the greenhouse temperature and humidity changed. The aim of these measurements was to investigate the role of both sap pH and percentage loss of hydraulic conductivity on stomatal regulation. The results obtained suggest that changes in sap pH are a response to vapor pressure deficit changes rather than to differences in soil water availability. We found significant correlation between stomatal conductance and sap pH, although no significant relationship was found between stomatal conductance and hydraulic conductivity. Variability in maximum hydraulic conductivity is discussed based on recent pit membrane constituent research. The study of hydraulic conductivity proved helpful in order to detect the clones with both higher growth and greater chance of survival, since clones displaying the lowest hydraulic conductivities were those that failed in commercial plantings. Anatomical xylem traits define the water transport efficiency to leaves and can therefore limit transpiration and growth. The third chapter of this PhD addresses anatomical xylem traits in poplar. One year old stem samples were taken from a water-stressed trial in Granada. The anatomical xylem study proved useful for detecting the lowest yielding genotypes. Clones with intermediate vessel size and high vessel densities were found to be those with the highest biomass yield. Differences in cavitation resistance depending on the clone tested and the water treatment applied were also found. The clones with the highest biomass yield were found to be among the most cavitation resistant clones in each watering regime. Xylem and physiological traits along with stomatal behavior are useful tools to determine plant growth. In order to study plantings or forests, it is more common to employ other physiological variables such as leaf area index (LAI). LAI estimation from hemispherical photographs applied to short rotation woody crops is a recently developed method that still requires fine tuning through further investigation. In the fourth chapter, data from LAI monitoring over two consecutive years were analyzed in two different locations where different irrigation treatments were applied. The results showed that differences in yield between genotypes, different irrigation regimes and years could be predicted by using the LAI estimates, either through direct or indirect estimation methods. Our studies of poplar and eucalyptus have shown that the field-grown genotypes with the lowest biomass yield displayed the lowest values of stomatal conductance under the most favorable environmental conditions and also had a low number of xylem conduits. The close relationship between LAI and growth highlights the importance of crown development in biomass growth. The highest LAI and biomass yield were recorded in one of the clones with higher vessel density and the lowest vulnerability to cavitation under stress conditions. These results underline the importance of research into anatomical and functional traits as factors influencing plant growth patterns and stomatal behavior.

Evaluación de Ulmus pumila L. y Populus spp. como cultivos energéticos en corta rotación

El presente trabajo estudia el empleo del olmo de Siberia (Ulmus Pumila L.) y el chopo (Populus spp.) en corta rotación y alta densidad para la producción de biomasa con fines energéticos. En el área mediterránea las disponibilidades hídricas son limitadas, por lo que la mayoría de los cultivos energéticos utilizados hasta el momento requieren el aporte de agua de riego; por ello resulta fundamental encontrar especies con bajos requerimientos hídricos, analizar la eficiencia en el uso del agua de diferentes materiales genéticos y optimizar la dosis de riego. Las parcelas experimentales se ubicaron en la provincia de Soria. En el ensayo llevado a cabo con olmo de Siberia se ha analizado el efecto en la producción de la disponibilidad de agua mediante el establecimiento de parcelas en secano y con dos dosis de riego (2000 m3 ha-1 año-1 y 4000 m3 ha-1 año-1 aproximadamente); además, al ser una especie poco estudiada hasta el momento, se ha estudiado también el efecto que tiene sobre el rendimiento la densidad de plantación (3.333 plantas ha-1 y 6.666 plantas ha-1), el tipo de suelo (2 calidades diferentes) y el turno de corta (3 y 4 años). En el caso del chopo, se han evaluado cuatro clones (AF-2, I-214, Monviso y Pegaso) establecidos con una densidad de 20.000 plantas por hectárea. Durante el primer ciclo de tres años se aportó el mismo volumen de riego a todas las parcelas, mientras que durante el segundo ciclo se establecieron 8 regímenes hídricos diferentes. Por otra parte, se ha investigado sobre el uso del potencial hídrico de las plantas para evaluar el estrés hídrico de las mismas y se ha estimado la producción de biomasa foliar y el Índice de Área Foliar (LAI) de ambas especies, relacionando los valores obtenidos con la dosis de riego y la producción de biomasa. Los resultados muestran que los suelos inundados reducen la tasa de supervivencia de los olmos durante el periodo de implantación, sin embargo la mortalidad durante los siguientes periodos vegetativos es baja y muestra buena capacidad de rebrote. La productividad (kg ha-1 año-1) obtenida fue mayor con un turno de corta de cuatro años que con turno de tres años. El área basal y la altura fueron variables eficaces para predecir la producción de biomasa del olmo de Siberia, obteniendo una variabilidad explicada de más del 80%. En cuanto a los parámetros que mayor influencia tuvieron sobre el crecimiento, el tipo de suelo resulto ser el más relevante, obteniéndose en un suelo agrícola considerado de buena calidad una producción en condiciones de secano de unos 8.000 kg ha-1 año-1. En condiciones de regadío el rendimiento del olmo de Siberia fue al menos el doble que en secano, pero la diferencia entre las dos dosis de riego estudiadas fue pequeña. La producción de biomasa fue mayor en la densidad de plantación más alta (6.666 plantas ha–1) en las parcelas de regadío, sin embargo no se encontraron diferencias significativas entre las dos densidades en secano. El clon de chopo que presentó un mayor rendimiento durante el primer ciclo fue AF-2, alcanzando los 14.000 kg ha-1 año-1, sin embargo la producción de este clon bajó sustancialmente durante el segundo ciclo debido a su mala capacidad de rebrote, pasando a ser I-214 el clon más productivo llegando también a los 14.000 kg ha-1 año-1. Un aporte adicional de agua proporcionó un incremento de la biomasa recogida, pero a partir de unos 6.500 m3 ha-1 año-1 de agua la producción se mantiene constante. El potencial hídrico foliar ha resultado ser una herramienta útil para conocer el estrés hídrico de las plantas. Los olmos de regadío apenas sufrieron estrés hídrico, mientras que los implantados en condiciones de secano padecieron un acusado estrés durante buena parte del periodo vegetativo, que se acentuó en la parte final del mismo. Los chopos regados con las dosis más altas no sufrieron estrés hídrico o fue muy pequeño, en las dosis intermedias sufrieron un estrés moderado ocasionalmente y únicamente en las dosis más bajas sufrieron puntualmente un estrés severo. El LAI aumenta con la edad de los brotes y oscila entre 2 y 4 m2 m−2 en los chopos y entre 2 y 7 m2 m−2 en los olmos. Se encontró una buena relación entre este índice y la producción de biomasa del olmo de Siberia. En general, puede decirse que el olmo de Siberia podría ser una buena alternativa para producir biomasa leñosa en condiciones de secano, mientras que el chopo podría emplearse en regadío siempre que se haga una buena elección del clon y de la dosis de riego. ABSTRACT This work explores the possibilities of biomass production, for energy purposes, of Siberian elm (Ulmus Pumila L.) and poplar (Populus spp.) in Spain. Irrigation is required for the viable cultivation of many energy crops in Mediterranean areas because of low water availability, for this reason species with low water requirements should be a good alternative for biomass production. Moreover, the optimal amount of irrigation water and the performance of the different genetic material in terms of production and water use efficiency should be studied in order to use water wisely. The experimental plots were established in the province of Soria in Spain. Given the small amount of information available about Siberian elm, besides studying the influence of water availability (rain-fed and two different irrigation doses) on biomass production, two different plantation densities (3,333 plants ha-1 and 6,666 plants ha-1), two different soil type and two cutting cycles (three years and four years) were assessed. In the case of poplar, four clones belonging to different hybrids (I-214, AF2, Pegaso, and Monviso) were included in a high density plantation (20,000 plants ha-1). During the first cycle, the water supplied in all plots was the same, while 8 different watering regimes were used during the second cycle. The suitability of the use of the leaf water potential to assess the water stress situations has also been investigated. Moreover, leaf biomass production and leaf area index (LAI) were estimated in both species in order to analyze the relationship between these parameters, irrigation dose and biomass production. The results shows that flooded soils have an adverse effect on elm survival in the implantation period, but the percentage of mortality is very low during the following vegetative periods and it shows a good ability of regrowth. The annual yield from a four-year cutting cycle was significantly greater than that from the three-year cutting cycle. Basal diameter and height are effective variables for predicting the production of total biomass; equations with R squared higher than 80% were obtained. The analysis of parameters having an influence on elm growth shows that soil type is the most important factor to obtain a good yield. In soils with enough nutrients and higher waterholding capacity, biomass productions of 8,000 kg ha-1 yr-1 were achieved even under rain-fed conditions. In irrigated plots, Siberian elm production was double than the production of biomass under rain-fed conditions; however, small differences were obtained between the 2 different irrigation doses under study. Biomass yield was greater for the highest planting density (6,666 plants ha–1) in irrigated plots, but significant differences were not found between the 2 densities in rain-fed plots. The clone AF-2 showed the highest production (14,000 kg ha-1 yr-1) during the first cycle, however during the second cycle its growth was lower because of a high mortality rate after regrowth and I-214 achieves the greatest production (14,000 kg ha-1 yr-1). An additional water supply provided a greater amount of biomass, but over about 6500 m3 ha-1 yr-1 of water the production is constant. Leaf water potential has been shown to be a useful tool for finding out plant water status. Irrigated elms hardly suffered water stress, while rain-fed elms suffered a pronounced water stress, which was more marked at the end of the vegetative period. Most of poplars did not show water stress; leaf water potentials only showed an important water stress in the plots irrigated with the lowest doses. LAI increases with shoot age and it ranges from 2 to 4 m2 m−2 in poplars and from 2 to 7 m2 m−2 in elms. A good relationship has been found between this index and Siberian elm production. In general, Siberian elm could be a good alternative to produce woody biomass in rainfed plots, while poplar could be used in irrigated plots if a suitable clone and irrigation dose are chosen.